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细胞毒性评价应用锦集

2017/10/8 16:16:27??????点击:

细胞毒性是化学物质(药物)作用于细胞基本结构及生理过程中,如细胞膜或细胞骨架结构、细胞新陈代谢、细胞组分或产物合成、降解或释放、离子调控及细胞分裂等过程改变,导致细胞存活、增殖及功能紊乱,所引发的不良反应等。利用多模式功能酶标仪检测系统,使用光吸收(比色法)、荧光、化学发光及时间分辨荧光等多种检测方法,可以对不同类型及机理引起的细胞毒性,进行多参数、全方位的检测及评价。


一、光吸收方法(比色法)

MTT类检测法:正常细胞代谢旺盛,其线粒体内的琥珀酸脱氢酶可将四唑盐类物质(如 MTT、XTT、WST-1等)还原为紫色甲臜结晶(Formazan),经DMSO溶解后,在酶标仪上读取490 nm波长的OD值,OD值大小和活细胞数量线性相关。

CCK8WST-8)检测法:CCK8检测方法同MTT类检测原理类似,利用线粒体内琥珀酸脱氢酶生成可溶于水的橙黄色甲臜物(不需要进一步裂解/溶解),即可直接在酶标仪上读取450 nm波长的OD值,OD值大小和活细胞数量线性相关。


LDH(乳酸脱氢酶)检测法LDH(乳酸脱氢酶)是一种稳定的蛋白质,存在于正常细胞的胞质中,一旦细胞膜受损,LDH即被释放到细胞外。LDH催化乳酸形成丙酮酸盐,和INT(四唑盐类)反应形成紫色的结晶物质,在酶标仪上读取500 nm波长的OD值,通过检测细胞培养上清中LDH的活性,可判断细胞膜受损引起的细胞毒性。

SRB检测法:磺酰罗丹明Sulforhodamine B,SRB)是一种粉红色阴离子染料,易溶于水,在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质碱性氨基酸结合,在540 nm波长下产生吸收峰,吸光值与细胞量成线性正相关,故可用作细胞存活数的定量检测。

二、荧光强度方法

阿尔玛蓝(Alamar Blue )检测法:也称刃天青(Resazurin),是一种安全无毒的蓝色染料。加入培养液中,可作为氧分子电子传递链的受体,呈现由蓝向红转变的颜色变化,反映所研究的细胞或微生物对氧分子的消耗,因而常被用作氧化还原指示剂,以显示被观察细胞和细菌的代谢活动。阿尔玛蓝的颜色改变可用光吸收测定(570nm测定吸光度,参考波长600nm)。阿尔玛蓝的粉红色细胞代谢产物,也可用荧光检测,其激发光波长在530-560 nm之间,发射光波长为590 nm。

线粒体膜电位JC-1检测法: 线粒体膜电位的下降是细胞毒性评价中细胞凋亡早期的一个标志性事件。 JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential△Ψm的理想荧光探针??梢约觳庀赴?、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光(EX 585 nm/ EM 590 nm);在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光(EX 514 nm/ EM 529 nm)。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。因此通过红绿荧光的相对比例,来衡量由于线粒体去极化引起的细胞早期凋亡。


三、化学发光方法

ATP检测法ATPLiteATP(三磷酸腺苷)是细胞活性的标志物,因为其仅存在于具有代谢活性的细胞内。因为当细胞经历坏死或凋亡时,ATP浓度会迅速下降,所以ATP是监测细胞毒性、杀伤、抑制和增殖的一种很好的指示剂。ATPLite方法检测的是荧光素酶和其底物D-luciferin反应所产生的光信号,在反应过程中需要消耗ATP,其产生的化学发光信号同ATP含量成正比。ATPLite检测方法灵敏度更高(最低5个细胞/孔),线性范围可达5个数量级,操作步骤简单,且信号更加稳定。


四、时间分辨荧光

时间分辨荧光(Time Resolved Fluorescence, TRF)是一种使用镧系元素(常用Eu)标记的非放射性检测方法。根据镧系元素螯合物的发光特点,用时间分辨技术测量其荧光,同时对发射波长和时间两个参数进行信号分辨,可有效地排除非特异背景荧光的干扰,极大地提高了检测的灵敏度,是所有非放射性、非均相检测方法中灵敏度最高的检测方法。目前该技术已广泛用于临床诊断,如新生儿筛查等,与传统高灵敏度的同位素检测方法相比,具有相当的灵敏度。

DNA片段化检测(DELFIA DNA fragmentation):该方法与TUNEL法类似,利用细胞中TdT酶的作用,对凋亡细胞中的片断化DNA3′-OH游离末端进行高效特异性标记Bio-dUTP(生物素偶联-UTP),随后加入Streptavidin –Eu(镧系元素标记的链霉亲和素)识别被标记的Bio-dUTP,最后加入Eu解离增强液,通过时间分辨荧光方法检测Eu镧系元素的发射信号来评价凋亡细胞中DNA片段化引起的细胞毒性。


DNA复制检测(DELFIA BrdU ProliferationBrdU是胸腺嘧啶的衍生物,常用于标记活细胞中新合成的DNA,可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)。这种掺入可以稳定存在,随着DNA复制进入子细胞中。使用Eu标记的BrdU 特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。Eu标记的BrdU 特异性抗体检测法与传统的同位素(3H-Thymidine标记掺入法相比,在检测灵敏度、信噪比、时间相关性及数据稳定上具有相同的优势,且安全性更高。



细胞膜通透性检测(DELFIA BATDA Cytotoxicity):与放射性同位素标记的51Cr释放试验测定细胞活性原理类似,在靶细胞中加入BATDA,BATDA能温和穿透细胞膜,对细胞无毒副作用,BATDA进入细胞后,被细胞内酯酶快速水解为亲水性的TDA,TDA不能在穿透细胞膜而滞留在细胞质内。当靶细胞被效应细胞(如NK细胞)识别或受到其他外界条件刺激后,造成细胞膜破损或细胞裂解,TDA就会释放到溶液中,被Eu标记物识别,最终通过检测Eu时间分辨荧光的信号,来评价细胞膜的完整性和通透性。该方法与传统放射性同位素标记的51Cr释放试验相比,检测灵敏度更高,操作时间更短,且灵活、安全。



(来源: 珀金埃尔默生命科学


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