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小分子半抗原抗体制备方法简述

2017/10/14 10:13:56??????点击:

大多数药物、毒素、环境污染物分子质量小于1000u(≈Da),属于仅有反应原性而无免疫原性的半抗原。目前制备小分子半抗原抗体的常规方法为:选择具有毒理学意义的代谢产物或原形药物作为待测物,设计合成保留待测物分子结构特征并带有活性基团的半抗原,通过共价键使半抗原与大分子质量蛋白质载体偶联,制备人工免疫原,经动物免疫程序制备针对半抗原的特异性抗体。其具体流程及各阶段简述如下。


hapten-antibodies


1、半抗原的设计及基本原则

半抗原设计的目的是使半抗原刺激机体产生特异性免疫应答,并获得对待测物分子具有高亲和力的抗体。

半抗原设计的基本原则如下:

1)免疫原中的半抗原应在分子结构、立体化学和电子分布上与待测物分子尽可能相似;

2)半抗原结构中的连接臂应不易于诱导产生“臂抗体”,最好使用一定长度的碳链;

3)半抗原分子应具有便于与蛋白载体偶联的活性基团(如-NH2、-COOH、-OH、-SH等),且活性基团的存在对待测物分子的电子分布应没有影响;

4)半抗原与蛋白偶联后仍应保留待测物分子的基本结构。


2、连接臂的引入

为突出待测物分子的特征结构,半抗原设计时常在特征结构和载体蛋白之间引入一定长度的连接分子,即连接臂。引入连接臂是半抗原抗体制备时较为常用的方案。

有研究报道,在制备小分子半抗原抗体时发现,当使用较短的连接臂或不使用连接臂时不能诱导产生针对半抗原的抗体,而具有较长连接臂的半抗原却能诱导产生针对半抗原的抗体。

人们对这种现象的解释是:当连接臂较短或没有连接臂时,半抗原有可能被载体蛋白的三维结构掩盖,而当连接臂足够长时,有利于小分子半抗原充分暴露与载体蛋白的表面,便于抗原递呈细胞对其的识别。通常认为连接臂的最适长度在3-6个直链碳原子之间,连接臂太短不利于半抗原的充分暴露,而连接臂太长又会因为疏水作用而造成烷基链的折叠,导致半抗原分子仍然被载体蛋白所掩盖,不利于抗原递呈细胞的识别。

此外有研究认为,使用不同结构的连接臂、采用不同的偶联方法或改变连接臂的引入位置,也有利于抗体的产生,提高抗体的亲和力和结合力。


3、活性基团的引入

活性基团的引入有两种方式:一是利用待测物上已有的活性基团(-NH2、-COOH、-OH、-SH等),通过双功能试剂(如NH2(CH2)nCOOH、SH(CH2)nCOOH、琥珀酸酐、戊二醛等)引入连接臂和活性基团,使之与载体蛋白偶联。这种方法的优点是比较容易实施,但对于一些待测物,若这些活性基团是其特征结构,或偶联后改变了分子的电子分布,则会影响抗体对待测物的识别。

另一种方法是直接合成待测物的带有-(CH2)nCOOH、-(CH2)nNH2等结构的衍生物,这种方法有利于?;ご馕锏奶卣鹘峁购头肿拥牡缱臃植疾皇苡跋?,但合成上有时比较困难,往往需要多步反应才能实现。


4、异质半抗原的使用

使用异质半抗原是一种间接提高抗体对待测物亲和力的方法。近年来,有研究者提出了利用“位阻效应”的半抗原设计理念,发现在人工免疫原的半抗原中合理引入不同程度的空间位阻,所诱导产生的多克隆抗体可以对一系列同系物中不同大小的分子进行选择性识别。

此外,有研究表明,在竞争性的免疫学检测方法中,包被原或酶标记物使用位阻较大的半抗原结构,可降低其对抗体的结合能力,从而相对地提高了游离待测物和抗体的亲和力,可以使灵敏度和特异性均得到较大的提高。


5、半抗原载体蛋白的选择

由于大多数药物、毒素、环境污染物等半抗原物质无免疫源性,通常需与大分子质量载体蛋白偶联制备完全抗原(免疫原),借助载体蛋白的T细胞表位获得免疫源性,以便刺激机体产生抗体。制备完全抗原时常用的载体有牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)、多聚赖氨酸(PLL)等。此外,为了获得更好的免疫效果,常使用免疫佐剂。

近年来,许多新型的载体和佐剂被应用于抗体的制备,其中一种由脂蛋白和Th细胞表面抗原决定簇的共价连接物(P3CS-Th)构成的低分子质量载体佐剂系统在小分子抗体的制备中表现出较好的效果和广阔的应用前景。

半抗原通过与载体蛋白结合形成复合物,往往可以是半抗原获得免疫源性而产生较好的抗体。但是对于分子量较小的半抗原,尤其是分子量小于300u的半抗原,有时难以获得针对药物小分子的高亲和力抗体。Chappey等对分子质量为111-1202u的半抗原诱导产生抗体的亲和系数做过研究,结果表明,分子质量为334-374u的半抗原诱导产生的抗体仍具有较高的亲和系数,但对于分子质量低于300u的半抗原,获得高亲和力抗体的可能性将显著下降,从而导致以竞争性酶联免疫吸附测定为代表的竞争性免疫分析方法检测灵敏度的下降。然而,近年发展起来的基因工程抗体有望解决这一难题。


6、基因工程抗体

噬菌体抗体库技术是利用基因工程技术发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术,与多克隆抗体和单克隆抗体相比,噬菌体抗体库技术的筛选范围广、时间周期短、操作方便、规模生产成本低廉。其基本原理是,获取抗体可变区重链和轻链基因,通过一段接头DNA拼接后,再与噬菌体头部蛋白G3P等基因5端重组,通过噬菌体表面展示技术把单链抗体表达在噬菌体表面,经抗原固定化筛选,实现了基因表达盒表达产物的亲和选择。

由于基因工程抗体在筛选方式及产量上所具有的明显优势,所以许多研究者认为基因工程抗体可以称为新的小分子半抗原抗体的来源。

此外,基因操作使人们可以通过融合蛋白基因表达的方式获得包括若干功能域和报告域的融合蛋白,通过这种方式可以制备同时具有免疫学特性功能域和酶催化特性报告域(如碱性磷酸酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白等)的融合蛋白,并利用其功能域对半抗原的亲和性和报告域的酶促级联放大作用进行免疫学检测,较之传统使用酶联第二抗体的方法节约了检测时间和检测成本。


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